Leloir, Luis Federico

(b. Paříž, Francie, 6. září 1906; D. Buenos Aires, Argentina, 2. Prosince 1987),

biochemie, nukleotidové cukry, syntéza oligoand polysacharidů.

Leloir obdržel v roce 1970 Nobelovu cenu za chemii za objev nukleotidových cukrů a roli těchto sloučenin při interkonverzi monosacharidů a jako prekurzorů při syntéze oligo-a polysacharidů. Jeho mnoho příspěvků k biochemii také zahrnuje první popis oxidace mastných kyselin v bezbuněčném systému, angiotensinogenu a jeho přeměny na angiotensin po inkubaci s renninem, a role sacharidů vázaných na lipidy jako meziproduktů v glykosylaci proteinů.

lékařský a biochemický trénink . Luis F. Leloir se narodil v Paříži ve Francii. Jeho Argentinští rodiče cestovali do francouzského hlavního města a hledali lékařské ošetření pro otce, právníka, který nikdy nevykonával svůj obchod. O dva roky později ho jeho matka (otec zemřel před leloirovým narozením) odvezla do Buenos Aires. Studoval medicínu na univerzitě v Buenos Aires a v roce 1932 se stal lékařem. V letech 1932-1934 působil jako internista ve Fakultní nemocnici a zároveň vykonával experimentální práci pro svou disertační práci pod vedením Bernarda a. Houssaye. Houssay byl ředitelem Fyziologického ústavu Univerzity v Buenos Aires a provedl pozoruhodné studie o úloze hypofýzy v metabolismu uhlohydrátů, za které v roce 1947 obdržel Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu. Leloirova disertační práce „nadledvina a uhlohydráty“ získala cenu 1934 School of Medicine award za nejlepší práci. V roce 1935 Leloir odešel do biochemické laboratoře Sira Fredericka Gowlanda Hopkinse na University of Cambridge pro postdoktorandský výcvik v biochemii. Ve Spojeném království se Leloir seznámil se současnými biochemickými technikami.

oxidace mastných kyselin a hypertenze . Zpět v Buenos Aires, Leloir pokračoval ve své práci na fyziologickém ústavu a řešil dva projekty (oxidace mastných kyselin a hypertenze) v letech 1937 až 1942. S Juanem m. Muñozem studoval metabolismus ethanolu a mastných kyselin. V sérii článků uvedli, že částicová frakce získaná z jaterních homogenátů, pokud je doplněna tetrakarbonovou dikarboxylovou kyselinou, cytochromem C a adenosinmonofosfátem, byla schopna udržet oxidaci mastných kyselin. To byl pozoruhodný příspěvek, protože do té doby se věřilo, že proces vyžaduje celistvost buněk. Nedostatek chlazené odstředivky téměř frustroval úspěšnou přípravu částicové frakce, ale leloirovo řemeslo, jedna z jeho silných stránek, poskytlo důmyslné a úsporné řešení překážky, když zabalil několik vnitřních trubek do auta naplněných mrazicí směsí kolem staré odstředivky poháněné kladkou. Jeho praktická vynalézavost byla mimořádně užitečná v zemi, jako je Argentina, kde byly výzkumné prostředky často vzácné.

druhým problémem, který Leloir v těchto letech řešil, byla maligní renální hypertenze. Jeho studium bylo pokračováno ve spolupráci s Muñozem, Eduardem Braunem Menendezem a Juanem C.Fasciolo. Pak bylo známo, že zúžení renální tepny psů vedlo k trvalé hypertenzi. Fasciolo pak ukázal, že zvýšení krevního tlaku také vyplynulo z roubování zúžené ledviny do normálního psa, což naznačuje, že účinek byl způsoben látkou, kterou léčená ledvina vylučovala do krve. Jedním z prvních zjištění skupiny bylo, že vodný acetonový extrakt zúžené ledviny byl schopen vyvolat přechodné zvýšení krevního tlaku. Vodná látka rozpustná v acetonu se lišila od reninu, již známé tlakové látky, která mohla být také extrahována z ledvin. Leloir a spolupracovníci pak zjistili, že inkubace reninu (proteázy) s krevní plazmou (která obsahovala to, co se nyní nazývá angiotensinogen), produkovala presorickou látku rozpustnou ve vodném acetonu (nyní nazývaném angiotensin). Leloirova znalost biochemie byla v těchto zjištěních zásadní.

Nukleotidové Cukry . Argentina zažila vojenský převrat v Argentině v roce 1943. Brzy poté, Houssay, spolu s mnoha dalšími významnými osobnostmi, poslal úřadům veřejný dopis požadující návrat k “ ústavní normalitě, efektivní demokracie, a Americká solidarita.““Americká solidarita“ byla eufemismem pro sousedící Argentinu se Spojenci ve druhé Světové Válce. nová vláda, která měla určité sympatie s osou, reagovala propuštěním všech signatářů, kteří byli veřejnými zaměstnanci. Houssay, jako univerzitní profesor, spadl do této kategorie. Po jeho propuštění následovala rezignace většiny vědeckých pracovníků Fyziologického ústavu,

Leloir mezi nimi, v solidaritě s Houssayem. Leloir poté odcestoval do Spojených států, kde nejprve pracoval s Edem Hunterem na tvorbě kyseliny citronové v laboratoři Carla a Gertyho Corise na Washingtonské univerzitě v St. Louis a poté s Davidem Greenem (s nímž již pracoval v Cambridge) na Columbia University v New Yorku na oddělení aminotransferáz. V roce 1943 se Leloir oženil s Amelií Zuberbuhlerovou. Výsledkem tohoto šťastného manželství byla dcera a devět vnoučat.

po návratu do Argentiny, Leloir v 1945 přidružený k Ústavu experimentální biologie a medicíny, který byl nedávno slavnostně otevřen v Buenos Aires hostit Houssay a většina bývalých členů Ústavu fyziologie. Leloir pak začal přijímat spolupracovníky, z nichž první byl Ranwel Caputto, lékař, který, stejně jako Leloir, absolvoval postdoktorandské školení v biochemii s Malcolmem Dixonem na University of Cambridge. Další byl pozván mikrobiolog Raúl Trucco, protože záměrem bylo studovat oxidaci mastných kyselin v bakteriích. Carlos Cardini a Alejandro Paladini se brzy připojili ke skupině. V té době se Jaime Campomar, textilní průmyslník, rozhodl financovat novou instituci věnovanou biochemickému výzkumu a oslovil Houssaye o radu při výběru svého ředitele. Houssay rychle navrhl Leloira pro tuto práci a ten měl být ředitelem Instituto de Investigaciones Bioquímicas Fundación Campomar (Institut pro biochemický výzkum Campomar Foundation; nyní se nazývá Fundación Instituto Leloir) po zbytek svého života. Ústav byl slavnostně otevřen v listopadu 1947 v malém, jednopatrový, a poměrně starý dům, který sousedil s Institutem režírovaným Houssayem. Postava 1 zobrazuje počáteční výzkumnou skupinu na centrální terase ústavu.

protože experimenty s oxidací mastných kyselin vedly k pochybným výsledkům, skupina se rozhodla přejít své úsilí na studium syntézy laktózy(disacharid složený z galaktózy plus glukózy, Gal a Glc). Caputto tvrdil, že během své diplomové práce byl schopen syntetizovat disacharid na inkubaci glykogenu (viz níže) s extraktem mléčné žlázy. Protože tyto výsledky nemohly být opakovány, Leloir navrhl místo toho studovat degradaci laktózy, protože tento proces by mohl

poskytnout informace o syntetické cestě. Tato předpověď se ukázala jako správná. Při zpětném pohledu lze spekulovat, že to, co Caputto pozoroval, byla pravděpodobně tvorba maltózy (jiného disacharidu, ale obsahujícího dvě glukózy) amylolytickou degradací polysacharidu. Identifikace disacharidů byla v té době založena na nespolehlivých metodách, jako morfologie krystalů derivátů vzniklých při reakci s fenylhydrazinem (osazony).

pro plánovaný výzkum se skupina rozhodla použít extrakt bez buněk odvozený z kvasinek (Saccharomyces fragilis) přizpůsobený růstu na laktóze jako zdroji uhlíku. Vědci nejprve detekovali laktázu, která degradovala disacharid na jeho monosacharidové složky, a poté galaktokinázu, která fosforylovala galaktózu na galaktózu 1-fosfát (Gal 1-P). Přeměna Poslední sloučeniny na glukózu 6-P (Glc 6-P) vyžadovala dva neznámé termostabilní faktory: glukóza 1,6 difosfát (Glc 1,6 diP) pro přeměnu glukózy 1-P (Glc 1-P) na Glc 6-P a uridin difosfátová glukóza (UDP-Glc)pro konverzi Gal 1-P na Glc 1-P. stanovení struktury UDP-Glc bylo skutečnou silou, vzhledem k minimálnímu množství dostupných činidel a vybavení. Zjistili, že sloučenina má jeden GLC zbytek na dva fosfáty a že se absorbuje v ultrafialovém světle, ale absorpční spektrum bylo spektrum neznámé látky (do té doby byla známa pouze spektra sloučenin obsahujících adenosin). Jednoho dne Caputto přišel do ústavu ve vzrušeném stavu a nesl poslední číslo časopisu Journal of Biological Chemistry zobrazující V jednom z článků spektrum uridinu, které se shodovalo s spektrem nové látky. Obrázek 2 je karikatura nakreslená Leloirem ukazující náladu skupiny před řešením struktury UDP-Glc.

takzvaná Leloirova dráha může být pak reprezentována jako:

Gal + ATP → Gal 1-P + ADP

Gal 1-P + UDP-Glc → UDP-Gal + Glc 1-P

UDP-Gal UD UDP-Glc

Glc 1-P → Glc 6-P

kde UDP-gal je zkratka pro uridin difosfát galaktózu.

UDP-Glc byl prvním nukleotidovým cukrem, který byl popsán, a cesta ukazuje první roli těchto nových sloučenin, která se podílí na interkonverzi monosacharidů. Ve výše popsaném případě bylo prokázáno, že přeměna UDP-Gal na UDP-Glc vyžaduje NAD (nikotinamidadenin dinukleotid), protože inverze skupiny OH v C4 probíhá oxidoredukční reakcí. Dále popis cesty poskytl úplné vysvětlení galaktosémie, lidského vrozeného onemocnění, které je charakterizováno neschopností metabolizovat galaktózu. Většina pacientů má nedostatek enzymu zapojeného do druhé reakce popsané výše, zatímco v mírnější formě onemocnění je galaktokináza nedostatečným enzymem.

jak uvádí také Leloir a spolupracovníci, obecná cesta syntézy nukleotidového cukru může být reprezentována jako:

NTP + monosacharid 1 – P → NDP-monosacharid + PP

kde NTP znamená nukleosidtrifosfáty (ATP, UTP, GTP a CTP) a PP pro pyrofosfát. Z téměř stovky nukleotidových cukrů, které jsou nyní známy, bylo několik z nich (GDP-Man, UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc a ADP-Glc) poprvé popsáno Leloirem a spolupracovníky.

byla vznesena otázka, zda UDP-Glc má vedle účasti na mezikonverzi monosaccha-ride další úlohu, protože UDP-Glc byl detekován také u kmenů kvasinek, které nejsou schopny použít galaktózu pro růst. Metoda poté použitá pro kvantifikaci UDP-Glc (zrychlení transformace Gal 1-P na GLC 1-P) poskytla důkaz pro druhou roli nukleotidových cukrů, což jsou meziprodukty v reakcích přenosu monosacharidů. Zmizení UDP-Glc inkubované s kvasnicovým extraktem probíhalo vyšší rychlostí za přítomnosti přidaného Glc 6-P. Tento účinek byl rychle vysledován Leloirem a novým spolupracovníkem Enrico Cabibem k tvorbě treahalózy 6-P. (trehalóza je disacharid složený ze dvou glukóz, odlišných od maltózy.) Reakce pak může být popsána jako:

UDP-Glc + glukóza 6-P → trehalóza 6-P + UDP

podobně brzy poté, co Leloir popsal syntézu sacharózy 6-P (sacharóza je sofistikovaný název pro náš denní cukr, složený ze dvou monosacharidů, Glc a fruktózy), za použití extraktů z pšeničných klíčků:

UDP-Glc + fruktóza 6-P → sacharóza 6-P + UDP.

je zajímavé, že syntéza laktózy, která byla prvním cílem projektu, nebyla popsána Leloirem a jeho spolupracovníky, ale v roce 1961 Winifredem m. Watkinsem A W. z. Hassidem, pracujícím s extrakty mléčné žlázy („syntéza laktózy částicovými enzymovými přípravky z morčat a bovinních mléčných žláz“). Postupuje takto:

UDP-Gal + Glc → laktóza + UDP

glykogen je rezervní polysacharid tvořený mnoha glukózovými jednotkami přítomnými v různých organismech, od bakterií po savce. Rostliny mají navíc další polysacharid (škrob) strukturálně úzce související s glykogenem. V pozdních 1930s a brzy 1940s, Carl a Gerty Cori, v sérii článků, popsal inkubaci Glc 1-P s extraktem savčích buněk vedoucí k syntéze glykogenu podle následující (reverzibilní) reakce:

Glc 1-P +(Glc)n ← (Glc)n + 1 + P

kde (Glc)n znamená glykogen obsahující n Glc molekuly. Zúčastněný enzym (glykogen fosforyláza) byl krystalizován. Po mnoho let se to bralo jako cesta syntézy glykogenu, i když se brzy objevily některé protichůdné zprávy. Například aplikace adrenalinu na zvířata, která vedla k aktivaci fosforylázy, vedla k degradaci glykogenu, nikoli k syntéze glykogenu. Navíc hladiny P v živých tkáních naznačovaly, že rovnováha byla ve výše uvedené rovnici posunuta zprava doleva. V roce 1957 Leloir a Cardini uvedli v „biosyntéze glykogenu z Uridindifosfátové glukózy“, že inkubace UDP-Glc s extraktem savčích buněk vedla k syntéze glykogenu. Syntetická reakce pak byla:

UDP-Glc + (Glc)n → (Glc)n+1 + UDP.

bylo zjištěno, že aktivita zapojeného enzymu (glykogen syntetázy) je vysoce regulována, aby umožnila akumulaci polymeru v dobách hojnosti a jeho degradaci v době potřeby.

Měnící Se Časy: 1958-1970 . Jaime Campomar zemřel v roce 1956, a když se jeho dědicové rozhodli ukončit financování institutu, Leloir se téměř rozhodl jej nadobro zavřít. Naštěstí však řada událostí pomohla odradit Leloira od tak drastického rozhodnutí. Za prvé, Leloir požádal a získal Velkorysý grant od National Institutes of Health ve Spojených státech. Za druhé, vláda generála Juana Perona, která nebyla přátelská k vysokoškolskému vzdělávání a výzkumu, byla sesazena v roce 1955. Nová vláda obnovila autonomii veřejných vysokých škol a vytvořila Národní radu pro výzkum, instituci, která poskytovala finanční prostředky na výzkum a pozice na plný úvazek. Houssay se stal jeho prvním prezidentem a tuto funkci zastával až do své smrti v roce 1971. Budova, ve které sídlil leloirův institut, byla téměř úplně zchátralá. (Vlastníma rukama postavil řadu vnitřních kanálů, aby zabránil úniku dešťové vody z poškození časopisů a knih v knihovně.) Post-Peronistická vláda však leloirovi nabídla mnohem větší budovu (bývalou jeptiškovu školu) a on I Houssay do ní přestěhovali své ústavy. Kromě toho byla v roce 1958 zahájena plodná asociace mezi Leloirovým Instituto de Investigaciones Bioquímicas Fundación Campomar a School of Sciences University of Buenos Aires. Leloir byl jmenován profesorem výzkumu na Fakultě věd Univerzity.

Leloir věnoval první roky v nové budově studiu regulace glykogen syntetázy metabolity (hlavně Glc 6-P) a interkonverzí mezi aktivními a neaktivními formami vyvolanými fosforylací a defosforylací. Zjistil také, že prekurzorem při syntéze škrobu nebyl UDP-Glc, ale nový nukleotidový cukr, adenosin difosfátová glukóza (ADP-Glc). Protože UDP-Glc vykazoval špatné začlenění glukózy do polysacharidu v testech bez buněk, vyzkoušel několik syntetických nukleotidových cukrů a zjistil, že ADP-Glc byl zdaleka nejlepším prekurzorem. Poté izoloval sloučeninu z přírodních zdrojů(kukuřice). Dalším problémem, který upoutal Leloirovu pozornost, byla syntéza glykogenu s vysokou molekulovou hmotností (částic). Zjistil, že polysacharid syntetizovaný ve zkumavce buď glykogen fosforylázou z Glc 1-P nebo glykogen syntetázou z UDP-Glc byl diferencovaně rozložen řadou fyzikálních a chemických ošetření. Skutečnost, že polysacharid tvořený syntetázou z UDP-Glc ve zkumavce vykazoval vlastnosti rozkladu identické s vlastnostmi nativních molekul, byla definitivní demonstrací, že UDP-Glc byl skutečným prekurzorem glykogenu in vivo.

Nobelovu cenu a později . Dne 20. října 1970 švédská akademie věd oznámila udělení Nobelovy ceny za chemii Luisovi F. Leloirovi za objev nukleotidů cukru a jejich role v biosyntéze sacharidů. V té době už začal, co bude jeho posledním velkým přínosem pro biochemii.

Phillips Robbins na Massachusetts Institute of Technology a Jack Strominger na Harvardské univerzitě v polovině šedesátých let zjistili, že mono – a oligosacharidy vázané na lipidy se chovají jako biosyntetické meziprodukty mezi nukleotidovými cukry a několika polysacharidovými složkami bakteriální buněčné stěny. Lipidová část byla identifikována jako polyprenol (undekaprenol) fosfát. Leloir pak popsal, jak inkubace jaterních membrán potkanů s UDP-Glc vedla k tvorbě dolichol-P-Glc, dolichol je polyprenol obsahující 20-21 isoprenových jednotek v savčích buňkách. Další inkubace dolichol-P-Glc vedla k přenosu monosacharidu na sloučeninu předběžně identifikovanou jako dolichol-P-P-oligosacharid (později se ukázalo, že je GlcNAc2 Man9 Glc3). Další inkubace tohoto posledního lipidového derivátu s membránami vedla k přenosu celého oligosacharidu na proteiny. Leloir tak vytvořil základ cesty vedoucí k syntéze glykoproteinů v eukaryotických buňkách a také poskytl první důkaz, který naznačuje, že oligosacharid vázaný na bílkoviny byl zpracován (tj. že monosacharidy byly z něj odstraněny a přidány do něj).

v roce 1978 starosta města Buenos Aires daroval půdu a vytvořil a předsedal výboru, který shromáždil finanční prostředky na výstavbu nové budovy. Na konci byly obdrženy stejné částky veřejných a soukromých prostředků. K přesunu do nových prostor došlo v prosinci 1983. Leloir tam měl pokračovat ve výzkumu čtyři roky.

Leloir muž . Leloir patřil ke staré a bohaté Argentinské rodině, okolnost, která mu umožnila plně věnovat svůj čas základnímu výzkumu, když financování takových snah v zemi téměř neexistovalo. Osobně kryl finanční prostředky na většinu předplatného vědeckých časopisů obdržených v knihovně ústavu a plně věnoval svůj plat jako profesor výzkumu na univerzitě v Buenos Aires Ústavu. Leloir měl nízkou profilovou osobnost; vyhýbal se veřejné expozici a projevoval extrémně jemný a vynikající smysl pro humor. Leloir byl tvrdý dělník, který, až několik let před smrtí, pokračoval v práci na lavičce. Výzkum byl pro něj nejlepší z koníčků. (Nikdy neměl soukromou kancelář, místo toho přijímal návštěvy a dělal papírování v laboratoři.) Byl nesmírně zdvořilý a ke všem, nezávisle na jejich společenském postavení, se choval stejně nenáročně. Měl klidnou osobnost a projevoval určitý stupeň nepohodlí pouze tehdy, když se někdo choval hrubě nebo projevoval špatné chování. Leloirova osobnost výrazně přispěla k podstatnému potěšení z práce v jeho skupině nebo v jeho institutu.

bibliografie

díla LELOIRA

s Carlosem e. Cardinim. „Biosyntéza glykogenu z uridin-Difosfátové glukózy.“Journal of American Chemical Society 79 (1957): 6340-6341.

“ dvě desetiletí výzkumu biosyntézy sacharidů.“Science 172 (25. Června 1971): 1299-1303. Text Leloirovy Nobelovy přednášky.

“ biosyntéza polysacharidů z Buenos Aires.“V biochemii glykosidické vazby, editoval Romano Piras a Horacio G. Pontis. New York: Academic Press, 1972.

“ daleko a dávno.“Roční přehled biochemie 52 (1983): 1-15.

jiné zdroje

Cabib, Enrico. „Výzkum nukleotidů cukru přináší čest argentinskému Biochemikovi.“Věda 170 (6. Listopadu 1970): 608-609.

Cori, Carl F.; Gerty T. Cori; a Albert h. Hegnauer. „Resyntéza svalového glykogenu z Hexosemonofosfátu.“Journal of Biological Chemistry 120 (1937): 193-202.

Cori, Gerty T.; Carl F. Cori; a Gerhard Schmidt. „Úloha glukóza-1-fosfátu při tvorbě cukru v krvi a syntéze glykogenu v játrech.“The Journal of Biological Chemistry 129 (1939): 629-639.

Cori, Gerty T. a Carl F. Cori. „Krystalická svalová Fosforyláza: IV. tvorba glykogenu.“Journal of Biological Chemistry 151 (1943): 57-63.

Kresge, Nicole; Robert D. Simoni; a Robert L. Hill. „Luis F. Leloir a biosyntéza sacharidů.“Journal of Biological Chemistry 280 (13. května 2005): 158-160.

Myrbäck, Karl. „Prezentační projev Nobelovy ceny za chemii 1970.“In Les Prix Nobel en 1970, editoval Wilhelm Odelberg. Stockholm, Švédsko: Nobelova Nadace, 1971.

Parodi, Armando J. “ Leloir, su Vida y su Ciencia.“Ciencia Hoy 16 (Srpen-Září 2006): 23-30.

Watkins, Winifred m. a William Z. Hassid. „Syntéza laktózy částicovými enzymatickými přípravky z morčat a mléčných žláz skotu.“Journal of Biological Chemistry 237 (1962): 1432-1440.

Armando J. Parodi